原理
欲从经 CsCl 梯度纯化的 DNA 中去除溴化乙锭,常用有机溶剂反复抽提的方法。随后可用透析或沉淀的方法去除 CsCl。
材料与仪器
DNA 样品
乙醇 水饱和的异戊醇或 n-丁醇 酚 TE
透析管和夹 离心机和转头
乙醇 水饱和的异戊醇或 n-丁醇 酚 TE
透析管和夹 离心机和转头
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
乙醇,水饱和的异戊醇或 n-丁醇(从离心制备的 DNA 中去除溴化乙锭要上述两种有机溶剂之一。),酚,酚:氯仿(1:1, V/V),TE ( pH 8.0)。
2. 核酸和寡核苷酸
通过 CsCl 梯度离心纯化的 DNA 样品
3. 离心机和转头
带有 HL-4 的转头和 50 ml 离心管的 Sorvall RT-6000 离心机(或与其相当的设备)
Sorvall SS-34 转头(或与其相当的转头)
4. 专用设备
透析管和夹或用于旋转透析的微量浓缩器(Amicon) 。
二、方法
1. 提取 DNA 溶液、去除溴化乙锭
(1) 将 DNA 溶液加到玻璃管或塑料管中,加入等体积的水饱和的 n-丁醇或异戊醇,盖紧管盖。
(2) 振荡混合有机相和水相。
(3) 在室温下离心该混合物 3 min,450 g ( 用 HL-4 转头和 50 ml 的离心管在 Sorvall RT-6000 离心机上为 1500 r/min ) 或放置于室温直到有机相和水相分离。
(4) 用巴斯德吸管将上层有机相(呈漂亮的深粉红色)转移至适当的废物容器中。
(5) 重复抽提(按第 1~4步)4~6 次直到水相和有机相均不见粉红色。
2. 从 DNA 溶液中去除 CsCI
(1) 用乙醇沉淀法(按第 7~12步)从 DNA 溶液中去除 CsCl,或用微量浓缩器(Ami-con ) 进行旋转透析或用 2L TE ( pH 8.0 ) 过夜透析 16 h ( 不断换缓冲液 )。如果是用后两种方法之一,则可直接进行步骤 8。
(2) 欲从 CsCl-DNA 溶液中沉淀 DNA,则加入 3 倍于 CsCI 溶液体积的水,充分混匀。
附加的该步处理使 CsCl 得到稀释并防止其被乙酵沉淀。
(3) 向 DNA 溶液中加入 8 倍体积的乙醇(在第 2 步用水稀释前的 CsCl-DNA 溶液的体积为 1 体积)并充分混合,于 4℃ 存放至少15 min。
若让沉淀反应于 4℃ 过夜,则能得到较高的 DNA 回收率。
重要:若 DNA 的乙醇溶液存贮于 -20℃,则 CsCl 会沉淀。
(4) 在 4℃ 下用 20000 g 离心(Sorvall SS-34 转头 13000 r/min)15 min 收集 DNA 沉淀。
(5) 将上清液移注到洁净的离心管中,并加入等体积的乙醇溶液。于 4℃ 放置此混合物至少 15 min,然后于 20000 g 离心 15 min ( Sorvall SS-34转头 ),收集 DNA 沉淀。
(6) 用 70% 的乙醇洗涤上述两次所得的 DNA 沉淀,然后尽可能去除所加的 70% 的乙醇,并让残留液体于室温下挥发。
(7) 用 2 ml H2O 或 TE ( pH 8.0 ) 溶解 DNA 沉淀。
若用于 DNA 测序,DNA 应溶于 H2O 中;若 DNA 需长期保存,TE ( pH 8.0 ) 是更好的选择。
(8) 若此重溶后的 DNA 从其颜色或当在紫外线照射时发出的荧光判断还明显含有溴化乙锭,则再次用酚或酚:氯仿抽提一次,然后再用乙醇沉淀 DNA。
(9) 测定 DNA 终溶液的 OD260 值,计算 DNA 的浓度。分装成小份贮存于 -20℃。
1. 缓冲液和溶液
乙醇,水饱和的异戊醇或 n-丁醇(从离心制备的 DNA 中去除溴化乙锭要上述两种有机溶剂之一。),酚,酚:氯仿(1:1, V/V),TE ( pH 8.0)。
2. 核酸和寡核苷酸
通过 CsCl 梯度离心纯化的 DNA 样品
3. 离心机和转头
带有 HL-4 的转头和 50 ml 离心管的 Sorvall RT-6000 离心机(或与其相当的设备)
Sorvall SS-34 转头(或与其相当的转头)
4. 专用设备
透析管和夹或用于旋转透析的微量浓缩器(Amicon) 。
二、方法
1. 提取 DNA 溶液、去除溴化乙锭
(1) 将 DNA 溶液加到玻璃管或塑料管中,加入等体积的水饱和的 n-丁醇或异戊醇,盖紧管盖。
(2) 振荡混合有机相和水相。
(3) 在室温下离心该混合物 3 min,450 g ( 用 HL-4 转头和 50 ml 的离心管在 Sorvall RT-6000 离心机上为 1500 r/min ) 或放置于室温直到有机相和水相分离。
(4) 用巴斯德吸管将上层有机相(呈漂亮的深粉红色)转移至适当的废物容器中。
(5) 重复抽提(按第 1~4步)4~6 次直到水相和有机相均不见粉红色。
2. 从 DNA 溶液中去除 CsCI
(1) 用乙醇沉淀法(按第 7~12步)从 DNA 溶液中去除 CsCl,或用微量浓缩器(Ami-con ) 进行旋转透析或用 2L TE ( pH 8.0 ) 过夜透析 16 h ( 不断换缓冲液 )。如果是用后两种方法之一,则可直接进行步骤 8。
(2) 欲从 CsCl-DNA 溶液中沉淀 DNA,则加入 3 倍于 CsCI 溶液体积的水,充分混匀。
附加的该步处理使 CsCl 得到稀释并防止其被乙酵沉淀。
(3) 向 DNA 溶液中加入 8 倍体积的乙醇(在第 2 步用水稀释前的 CsCl-DNA 溶液的体积为 1 体积)并充分混合,于 4℃ 存放至少15 min。
若让沉淀反应于 4℃ 过夜,则能得到较高的 DNA 回收率。
重要:若 DNA 的乙醇溶液存贮于 -20℃,则 CsCl 会沉淀。
(4) 在 4℃ 下用 20000 g 离心(Sorvall SS-34 转头 13000 r/min)15 min 收集 DNA 沉淀。
(5) 将上清液移注到洁净的离心管中,并加入等体积的乙醇溶液。于 4℃ 放置此混合物至少 15 min,然后于 20000 g 离心 15 min ( Sorvall SS-34转头 ),收集 DNA 沉淀。
(6) 用 70% 的乙醇洗涤上述两次所得的 DNA 沉淀,然后尽可能去除所加的 70% 的乙醇,并让残留液体于室温下挥发。
(7) 用 2 ml H2O 或 TE ( pH 8.0 ) 溶解 DNA 沉淀。
若用于 DNA 测序,DNA 应溶于 H2O 中;若 DNA 需长期保存,TE ( pH 8.0 ) 是更好的选择。
(8) 若此重溶后的 DNA 从其颜色或当在紫外线照射时发出的荧光判断还明显含有溴化乙锭,则再次用酚或酚:氯仿抽提一次,然后再用乙醇沉淀 DNA。
(9) 测定 DNA 终溶液的 OD260 值,计算 DNA 的浓度。分装成小份贮存于 -20℃。
来源:丁香实验