材料与仪器
消化缓冲液 经 TPCK 处理的胰蛋白酶 HCl 纯的钙调蛋白
步骤
材料
经 TPCK 处理的胰蛋白酶(其干粉可从 WorthingtonBiochemicalCorp. 买到)
HCl(1 mmol/L)
纯的钙调蛋白(干粉;无盐(0.1~1 mg)
试剂
消化缓冲液
(配方,见"试剂的配制',PP.82~83)
操作程序
1) 称重 0.1~1mg 胰蛋白酶于 1.5-ml 离心管,并溶于 1mmol/LHCl 中,终浓度为 1 mg/ml。置冰上。
2) 用消化缓冲液溶解钙调蛋白,终浓度为 1 mg/ml 置冰上。
3) 加一等分胰蛋白酶于钙调蛋白。该等分含胰蛋白酶的重量应为钙调蛋白总量的 1/100。例如,对 0.5 mg 钙调蛋白,加 5ug 胰蛋白酶(5ullmg/ml 胰蛋白酶储液)。
4) 盖紧离心管,反应混合物于 37°C 孵育 2 h。
5) 在消化反应正在进行的同时,置剩余的胰蛋白酶储液于冰上。2 h 后,加另一等分胰蛋白酶(重量还是钙调蛋白的 1/100) 于消化混合物。盖紧离心管,再继续在 37°C 下孵育 4~8 h(或过夜,如可能)。
6) 反应结束时,可将祥品冻干至所需要的程度,或真空离心缩小体积,或直接进样作 HPLC 分离。样品可用 HC1 或三氟乙酸酸化至 pH2~3 以终止反应。不过,采取此操作时,要担点风险,此时,有些等电点低的肽段可能会产生沉淀。
经 TPCK 处理的胰蛋白酶(其干粉可从 WorthingtonBiochemicalCorp. 买到)
HCl(1 mmol/L)
纯的钙调蛋白(干粉;无盐(0.1~1 mg)
试剂
消化缓冲液
(配方,见"试剂的配制',PP.82~83)
操作程序
1) 称重 0.1~1mg 胰蛋白酶于 1.5-ml 离心管,并溶于 1mmol/LHCl 中,终浓度为 1 mg/ml。置冰上。
2) 用消化缓冲液溶解钙调蛋白,终浓度为 1 mg/ml 置冰上。
3) 加一等分胰蛋白酶于钙调蛋白。该等分含胰蛋白酶的重量应为钙调蛋白总量的 1/100。例如,对 0.5 mg 钙调蛋白,加 5ug 胰蛋白酶(5ullmg/ml 胰蛋白酶储液)。
4) 盖紧离心管,反应混合物于 37°C 孵育 2 h。
5) 在消化反应正在进行的同时,置剩余的胰蛋白酶储液于冰上。2 h 后,加另一等分胰蛋白酶(重量还是钙调蛋白的 1/100) 于消化混合物。盖紧离心管,再继续在 37°C 下孵育 4~8 h(或过夜,如可能)。
6) 反应结束时,可将祥品冻干至所需要的程度,或真空离心缩小体积,或直接进样作 HPLC 分离。样品可用 HC1 或三氟乙酸酸化至 pH2~3 以终止反应。不过,采取此操作时,要担点风险,此时,有些等电点低的肽段可能会产生沉淀。
来源:丁香实验