原理
材料与仪器
尿素 去污剂
聚丙烯酰胺凝胶
步骤
1. 等电聚焦凝胶的准备
双向电泳通常用聚丙烯酰胺凝胶作介质，但需含有 8 mol/L 尿素、0.5%~2% 非离子或两性离子去污剂。为了增加样品的可溶性，可加 0.5% CHAPS。在第一向电泳中，最重要的是用载体两性电解质建立 pH 梯度。如 载体两性电解质 pH 梯度等电聚焦 所述混合不同 pH 范围的载体两性电解质或使用预混合的载体两性电解质可以增加第一向电泳的分辨率。
O'Farrell 的 ISO-DALT 系统的第一向是用管状凝胶，虽然也能得到高分辨，且上样量大，对盐的耐受量也大，但会由于电内渗效应丢失碱性蛋白。平板等电聚焦时电极只与凝胶的边缘接触，电解体积小，阴极漂移小。相对来说不易丢失蛋白。将薄层凝胶聚合在支持膜上更能得到好的结果。
含有尿素、离子去污剂和载体两性电解质的凝胶聚合方法请参阅 载体两性电解质 pH 梯度等电聚焦。
2. 样品准备和加样
可溶蛋白的样品，如体液，细胞和组织的萃取液能直接用于双向电泳，但应稀释到合适的浓度。固体样品，如组织，细胞或在组织培养液中的细胞，加样前应先破碎，研磨和溶解。通常使用的溶解液是 O'Farrell 提出的 9 mol/L 尿素和 2% ( W/V）非离子去污剂（NP-40 或 Triton X-100 )。但对有些蛋白，如组蛋白、核糖体蛋白和膜蛋白的溶解仍然是困难的，必须做适当处理。
使用管状凝胶和垂直平板凝胶时，样品被加在浓缩胶的顶上，靠近电极容易引起蛋白的变化，水平电泳可加在凝胶的合适位置。有关样品的溶解、加样方法、加样量等请参阅 载体两性电解质 pH 梯度等电聚焦。
3. 等电聚焦
等电聚焦的方法同 载体两性电解质 pH 梯度等电聚焦。由于双向电泳用的第一向凝胶和样品中含有尿素和去污剂，聚焦时的温度应稍高于通常用的温度，如 15~20℃，以防止尿素结晶。如在凝胶上覆盖一层膜，也可以防止尿素结晶，并克服大气中二氧化碳的影响。由于尿素使蛋白变性，会增加蛋白分子的直径。鉴于以上一些原因， 应使用新鲜样品和凝胶，并适当降低电压和增加聚焦时间。
4. pH 梯度的测定
如采用表面电极进行测量，由于尿素和温度对 pH 的影响，应使用校正因子，请参阅 载体两性电解质 pH 梯度等电聚焦 的有关章节。
另一种方法是用蛋白标准作为内标准。常用的等电点蛋白标准不能用于双向分析，因为电泳条件不同。双向电泳的标准是选择一些合适的蛋白，在有尿素时加热不同时间得到的，最终在双向凝胶上呈现以一定 pH 单位间隔排列的点，点的数目取决于蛋白质氨基酸的组成。
5. 平衡
第二向 SDS 电泳前，将等电聚焦凝胶按样品泳道剪成胶条，用含有 SDS，在还原条件下的 pH 8.8 Tris 缓冲液平衡。目的是使蛋白质分子与 SDS 和还原试剂充分相互作用，解聚蛋白质分子，并与 SDS 结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束，以确保第二向的迁移。平衡时间是很重要的因素。柱状胶约需 30~40 分钟，薄层胶（0.5~1 mm ) 约需 5~10 分钟，超薄胶只需 1~2 分钟。
二、第二向
1. SDS 凝胶的准备
请参阅 SDS 聚丙酰胺凝胶电泳 各种不连续 SDS 凝胶灌注方法。
2. 二向间的转移
平衡后的等电聚焦凝胶条与 SDS 凝胶的良好接触是双向电泳结果的保证。管状凝胶的转移需要用琼脂糖密封，但琼脂糖中的不纯物在银染时会显现斑点。如用快速丙烯酰胺聚合的方法，聚合过程中产生的热会使蛋白变性。
垂直平板电泳时凝胶间的转移可以直接放置，但要防止胶条被拉长，否则蛋白带会歪斜而使双向电泳谱畸变。薄层水平电泳间的转移比较容易，因为凝胶聚合在支持膜上，只要将等电聚焦凝胶的胶面向下，贴于 SDS 凝胶上，避免气泡陷入即可。为了以后分子质量的测定，在 SDS 凝胶的一端应加分子质量蛋白标准。
3. SDS 电泳
请参阅 SDS 聚丙酰胺凝胶电泳 SDS 电泳的方法。
4. 检测
考马斯亮蓝染色、银染色、荧光标记、放射自显影等检测方法请参阅 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 和 SDS 聚丙酰胺凝胶电泳。由于双向电泳的高分辨率，分离的蛋白斑点无法用肉眼来比较和辨别，应该用凝胶扫描或摄录系统将数据进行处理。
注意事项
常见问题
常见问题：
1.重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？
一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。
2.为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？
通常情况下，等点聚焦中体系内除了蛋白质还会存在少量带电小分子，当这些带电小分子在电场中向两极运动时，会带动胶条中的水分子运动，水分子运动会带动附近的覆盖油移动，当样品质量不高，带电小分子较多时，会导致覆盖油移动严重溢出胶条槽，此时，通常会伴随胶条的酸性端胶条厚度增加。当发生覆盖油溢出或胶条暴露时，应及时补加覆盖油。为了防止这个现象的发生，应从样品制备时严格控制样品质量，尽量减少带电小分子如盐离子的含量。同时可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（80 %满）的覆盖油。
3.跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压（50 μ A/ 胶）？
电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，修饰蛋白，从而对等电聚焦产生影响。
4.跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？
刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动，而蛋白质运动需要较高的电压。
5.跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？
蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。
6.跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？
当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。
跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？
当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。
7.跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？
等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中性分子。这时加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
8.重泡胀缓冲液（rehydration buffer）中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？
硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。
9.怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值？
可以根据胶条的pH范围和长度估算蛋白质点的pI值，在第二向中加入分子量Marker估算蛋白质点分子量。也可以用体系内已知蛋白来做比对。
10.为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？
横的脱尾可能是：1）一向等电聚焦不完全； 2）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）； 3）蛋白的丰度太高。竖的脱尾可能是1）平衡时碘乙酰胺量不足；2）跑二向时，蛋白的溶解度不好。
11.什么成分会影响 2D 胶的效果？
核酸，盐，去垢剂等等。
12.2D 胶的上样量应该在什么范围？
上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在 100 微克（银染）到 500 微克（考染）之间。
13.我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？
蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。沉淀法中，又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境（不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。
来源：丁香实验
