原理
尿液经酸水解，使结合型17-酮类固醇变游离型17-酮类固醇。后者在碱性溶液中能与间二硝基苯反应呈红色。
材料与仪器
步骤
一、. 实验试剂：
1. 无水乙醇
2. 10/1000 间二硝基苯溶液
3. 5mol/L的KOH
4. 70％去醛乙醇
5. 雄酮标准溶液（1ml=0.2mg）
二、实验操作方法：
l. 取洁净容器加人10ml浓HCL作为防腐剂。然后收集24h尿液准确记录总尿量。
2. 将尿液混匀吸取5ml于三角烧杯中，加冰酯酸5ml加热沸腾，回流水解10min，流水冷却。
3. 此经水解的尿液放入分液漏斗中，加入乙醚(AR)约20ml振摇2-3min,静置分层以后,弃去下层尿液.
4. 加lmol/L的NaOH 10ml轻轻颠倒20次，弃去NaOH层，再加蒸馏水15ml轻轻颠倒20次，弃去NaOH层，再加蒸馏水15mL轻轻颠倒20次，弃去水层。
5. 将洗过的乙醚提出液放入一只有20ml刻度的大试管中，用少量乙醚洗漏斗壁，此洗涤乙醚放入大试管中，然后加乙醚补充至20ml刻度混匀。
6. 取2支大试管每管各取上乙醚提出液5ml一管作测定，另一管作测定空白，置37℃干燥箱中使乙醚挥发干。
7. 取上述制备的标准管一支，内含雄酮0.02mg。
以上各管按表进行操作：
混匀在530nm波长处以70%去醛乙醇溶液调零分别读取各管吸光度。
三、 计算：
（测定管吸光度-测定空白管吸光度-试管空白吸光度）/（标准管吸光度-试管空白吸光度）×0.02×24h尿总量(ml)/[(5/20)×5]= 17-酮类固醇mg/24h尿
1. 无水乙醇
2. 10/1000 间二硝基苯溶液
3. 5mol/L的KOH
4. 70％去醛乙醇
5. 雄酮标准溶液（1ml=0.2mg）
二、实验操作方法：
l. 取洁净容器加人10ml浓HCL作为防腐剂。然后收集24h尿液准确记录总尿量。
2. 将尿液混匀吸取5ml于三角烧杯中，加冰酯酸5ml加热沸腾，回流水解10min，流水冷却。
3. 此经水解的尿液放入分液漏斗中，加入乙醚(AR)约20ml振摇2-3min,静置分层以后,弃去下层尿液.
4. 加lmol/L的NaOH 10ml轻轻颠倒20次，弃去NaOH层，再加蒸馏水15ml轻轻颠倒20次，弃去NaOH层，再加蒸馏水15mL轻轻颠倒20次，弃去水层。
5. 将洗过的乙醚提出液放入一只有20ml刻度的大试管中，用少量乙醚洗漏斗壁，此洗涤乙醚放入大试管中，然后加乙醚补充至20ml刻度混匀。
6. 取2支大试管每管各取上乙醚提出液5ml一管作测定，另一管作测定空白，置37℃干燥箱中使乙醚挥发干。
7. 取上述制备的标准管一支，内含雄酮0.02mg。
以上各管按表进行操作：
混匀在530nm波长处以70%去醛乙醇溶液调零分别读取各管吸光度。
三、 计算：
（测定管吸光度-测定空白管吸光度-试管空白吸光度）/（标准管吸光度-试管空白吸光度）×0.02×24h尿总量(ml)/[(5/20)×5]= 17-酮类固醇mg/24h尿
注意事项
1. 所用的乙醇需要精制。
2. 市售间二硝基苯需要纯化。
3. 所用乙醇必须分析纯。
4. 当尿液用乙醚振摇混提出后如发现乙醚与尿液分层不明显，可加入饱和NaCL溶液数ml继续振摇之。
5. 水解时，采用硝酸较为温和且水解较安全。
6. 所需试管吸管需干燥无水，否则影响结果。
7. 本法所显色不够稳定，颜色化合物对光敏感故显色及比色时均应暗处进行，比色步骤须于加完试剂后6-12min完成，大批标本宜分批显色。
2. 市售间二硝基苯需要纯化。
3. 所用乙醇必须分析纯。
4. 当尿液用乙醚振摇混提出后如发现乙醚与尿液分层不明显，可加入饱和NaCL溶液数ml继续振摇之。
5. 水解时，采用硝酸较为温和且水解较安全。
6. 所需试管吸管需干燥无水，否则影响结果。
7. 本法所显色不够稳定，颜色化合物对光敏感故显色及比色时均应暗处进行，比色步骤须于加完试剂后6-12min完成，大批标本宜分批显色。
来源：丁香实验
