原理
吸收光谱重叠的a，b组分共存时，若要测定b组分，利用双波长分光光度法能消除a组分的干扰。其方法是选取二个波长λ1和λ2，使组分a在这两个波长处的吸收度相等；而对欲测b组分，在两波长处的吸收度有显著差别。用这样两个波长测得混合物的吸收度之差△A，只与b组分的浓度成正比，而与a组分浓度无关。因此，可以消去a的干扰。
氨茶碱为临床常用平喘药，由茶碱和乙二胺结合而成。其在体液中很快分离出茶碱，在酸性条件下，可用有机溶剂从血清中提出茶碱。并同时沉淀血清蛋白；再用碱液把茶碱从有机溶剂中提出。在λ274和λ298处测定碱性提取液的吸收度（A），A274为茶碱和本底（溶剂、血清）吸收度，A298为本底的吸收度，茶碱的吸收度为△A=A274-A298，即可测定氨茶碱血药浓度。
氨茶碱为临床常用平喘药，由茶碱和乙二胺结合而成。其在体液中很快分离出茶碱，在酸性条件下，可用有机溶剂从血清中提出茶碱。并同时沉淀血清蛋白；再用碱液把茶碱从有机溶剂中提出。在λ274和λ298处测定碱性提取液的吸收度（A），A274为茶碱和本底（溶剂、血清）吸收度，A298为本底的吸收度，茶碱的吸收度为△A=A274-A298，即可测定氨茶碱血药浓度。
材料与仪器
家兔
氨茶碱注射液 茶碱标准品 异丙醇氯仿溶液 HCl溶液 NaOH溶液
外分光光度计 离心机 注射器 吸管 试管 刀片
氨茶碱注射液 茶碱标准品 异丙醇氯仿溶液 HCl溶液 NaOH溶液
外分光光度计 离心机 注射器 吸管 试管 刀片
步骤
1． 动物准备及给药
取体重2.5～3 kg健康家兔1只，一耳缘静脉注射氨茶碱15mg/ kg（2 min注完），另一耳用锐利刀片切割取血。
2． 取血
给药后0 min、10 min、20 min、30 min、60 min、120 min、180 min、300 min、420 min采用耳静脉切割法分别取静脉血2 ml。
3．茶碱标准曲线制作
取5支刻度试管，依次加入茶碱标准液20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，各加入0.1mol/LNaOH溶液4.0 ml，终浓度依次为0.5μg/ ml、1.0μg/ ml、1.5μg/ ml、2.0μg/ ml、2.5μg/ ml，以0.1mol/LNaOH溶液为空白，于274 nm、298 nm处测定吸收度，绘制ΔA～C曲线。
4． 血药浓度的测定
吸取血清0.5 ml至刻度试管中，加0.1 mol/LHCl溶液0.2 ml，5%异丙醇氯仿溶液5 ml，振摇、混合，离心（2500r/ min）10 min，吸取氯仿液（下层）4.0 ml置另一试管中，加入0.1mol/LNaOH溶液4.0 ml，摇匀，离心（2500r/ min）10 min。吸取碱液（上层）3～3.5 ml，以0.1 mol/LNaOH为空白，于274 nm、298 nm处测定吸收度，计算ΔA。
5． 将测得血清样品的△A代入标准曲线的方程，求得相应的C。
取体重2.5～3 kg健康家兔1只，一耳缘静脉注射氨茶碱15mg/ kg（2 min注完），另一耳用锐利刀片切割取血。
2． 取血
给药后0 min、10 min、20 min、30 min、60 min、120 min、180 min、300 min、420 min采用耳静脉切割法分别取静脉血2 ml。
3．茶碱标准曲线制作
取5支刻度试管，依次加入茶碱标准液20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，各加入0.1mol/LNaOH溶液4.0 ml，终浓度依次为0.5μg/ ml、1.0μg/ ml、1.5μg/ ml、2.0μg/ ml、2.5μg/ ml，以0.1mol/LNaOH溶液为空白，于274 nm、298 nm处测定吸收度，绘制ΔA～C曲线。
4． 血药浓度的测定
吸取血清0.5 ml至刻度试管中，加0.1 mol/LHCl溶液0.2 ml，5%异丙醇氯仿溶液5 ml，振摇、混合，离心（2500r/ min）10 min，吸取氯仿液（下层）4.0 ml置另一试管中，加入0.1mol/LNaOH溶液4.0 ml，摇匀，离心（2500r/ min）10 min。吸取碱液（上层）3～3.5 ml，以0.1 mol/LNaOH为空白，于274 nm、298 nm处测定吸收度，计算ΔA。
5． 将测得血清样品的△A代入标准曲线的方程，求得相应的C。
注意事项
1． 紫外分光光度计使用前需预热30min并激发氢灯。
2． 振摇混匀药液时防止溅出并准确加样。
3． 样品离心前需配平。
4． 测量时若更换波长，必须重新调节0和100％。
2． 振摇混匀药液时防止溅出并准确加样。
3． 样品离心前需配平。
4． 测量时若更换波长，必须重新调节0和100％。
来源：丁香实验
