原理
本实验以酵母RNA 为材料, 将RNA 用碱水解成单核苷酸,再用离子交换柱层析进行分离, 最后采用紫外吸收法进行鉴定。同时通过测定各单核苷酸的含量, 可以计算出酵母RNA 的碱基组成。
材料与仪器
酵母RNA
阴离子交换树脂 聚苯乙烯-二乙烯苯-三甲胺季铵 甲酸 甲酸钠 KOH 蒸馏水 过氯酸 NaOH HCl AgNO3
层析柱 梯度洗脱器 电磁搅拌器 恒流泵 自动部分收集器 酸度计 紫外分光光度计 旋涡混合器 核酸蛋白检测仪 台式离心机
阴离子交换树脂 聚苯乙烯-二乙烯苯-三甲胺季铵 甲酸 甲酸钠 KOH 蒸馏水 过氯酸 NaOH HCl AgNO3
层析柱 梯度洗脱器 电磁搅拌器 恒流泵 自动部分收集器 酸度计 紫外分光光度计 旋涡混合器 核酸蛋白检测仪 台式离心机
步骤
1. RNA 的碱水解
称取20 mg 酵母RNA, 置于刻度离心试管中, 加2ml 新配制的0.3 mol/ L KOH, 用细玻璃棒搅拌溶解, 于37 ℃ 水浴中保温水解20 h。然后用2 mol/ L HClO4 ( 过氯酸) 调水解液pH 至2以下( 要少量多次, 只需几滴即可) 。由于核苷酸在过酸的条件下易脱嘌呤, 所以滴加HClO4 时需用旋涡混合器迅速搅拌, 防止局部过酸, 再以4000 r/ min 的转速离心15 min , 置冰浴中10 min , 以沉淀完全。将上清液倒入另一刻度试管中, 用2 mol/L NaOH 逐滴将上清液pH 值调至8～9 , 作上样样品液备用。样品液上柱前, 取0.1 ml 稀释500 倍, 测定其在260 nm 波长处的光吸收值, 用以最后计算离子交换柱层析的回收率。
2. 离子交换树脂的预处理
取201x8 粉末型强碱型阴离子交换树脂8 克(湿) , 先用蒸馏水浸泡2 h , 浮选除去细小颗粒, 同时用减压法除去树脂中存留的气泡, 然后用四倍树脂量的0.5 mol/ L NaOH 溶液浸泡1 h ,除去树脂中的碱溶性杂质。用去离子水洗至近中性后, 再用四倍量1 mol/ L HCl 浸泡半小时, 以除去树脂中酸溶性杂质。接着用蒸馏水洗至中性( 可以上柱洗) , 此时阴离子交换树脂为氯型。
3. 离子交换层析柱的装柱方法
离子交换层析柱可使用内径约1 cm、长10 cm 的层析柱, 柱下端有烧结上的垂熔滤板, 柱上端使用橡皮塞, 塞子中间打一小孔。紧紧插入一根细聚乙烯管, 层析柱夹在铁架台上, 调成垂直, 柱下端细胶管用螺旋夹夹紧, 向柱内加入蒸馏水至2/3 柱高, 再用滴管将经过预处理的离子交换树脂加入柱内, 使树脂自由沉降至柱底, 放松螺旋夹, 使蒸馏水缓慢流出, 再继续加入树脂, 使树脂最后沉降的高度约为6～7 cm。注意在装柱和以后使用层析柱的过程中, 切勿干柱, 树脂不能分层, 树脂面以上要保持一定高度的液面(不能太高, 约1 cm) , 以防气泡进入树脂内部, 影响分离效果。
4. 树脂的转型处理
树脂的转型处理就是使树脂带上洗脱时所需要的离子。本实验需要将阴离子交换树脂由氯型转变为甲酸型。先用200 ml 1 mol/ L 甲酸钠洗柱, 用1% AgNO3 检查柱流出液, 直至不出现白色AgCl 沉淀为止。然后改用约200 ml 0.2 mol/ L 甲酸继续洗柱, 测定流出液的A260≤0.020 为止。最后用蒸馏水洗柱, 直至流出液的pH 值接近中性(或与蒸馏水的pH 相同) 。
5. 加入样品并淋洗除去不被树脂吸附的组分
加样就是将RNA 碱水解产物转移到离子交换层析柱内, 使其被离子交换树脂吸附。先将柱内液体用滴管轻轻吸去, 使液面下降到刚接近树脂表面。旋紧下端螺旋夹, 用滴管准确移取1.0 ml RNA 碱水解样品液, 沿柱壁小心加到树脂表面, 然后松开下端螺旋夹, 使样品液面下降至树脂表面, 接着用滴管加入少量蒸馏水, 当水面降至树脂表面时, 再用约200 ml 蒸馏水洗柱, 将不被阴离子交换树脂吸附的嘌呤及嘧啶碱基、核苷等杂质洗下来。检查流出液在260 nm 波长处的吸光度, 直至低于0.020 为止。关恒流泵, 旋紧柱下端螺旋夹。
6. 梯度洗脱
在梯度洗脱器的混合瓶内加入300 ml 蒸馏水, 贮液瓶中加入300 ml 0.20 mol/ L 甲酸-0.20 mol/ L 甲酸钠混合液(注意: 梯度洗脱器底部的连通管要事先充满蒸馏水, 赶尽气泡)。洗脱器出口与恒流泵入口用细塑料管相连, 打开两瓶之间的连通阀和出口阀, 打开电磁搅拌器, 松开柱下端螺旋夹, 开启恒流泵, 控制流速为5 ml / 管/ 10 分, 开启部分收集器, 分管收集流出液。以蒸馏水为对照, 测定各管在260 nm 波长下的A260 值, 给各管编号, 并标出最高峰的收集管。
7. 核苷酸的鉴定
分别测定最高峰管内液体在230～300 nm 之间, 每相差5 nm间隔的光吸收值。其中包括有250 nm、260 nm、280 nm, 290 nm各点( 注意: 液体均要保留, 切勿倒掉。测量时用石英杯)。由于在小于250 nm 时, 甲酸( HCOOH ) 具有很强的光吸收值,因此测定时所用参比对照液近似为:第一个峰用0.05 mol/ L 甲酸-0.05 mol/ L 甲酸钠。第二个峰用0.10 mol/ L 甲酸-0.10 mol/ L 甲酸钠。第三个峰用0.15 mol/ L 甲酸-0.15 mol/ L 甲酸钠。第四、五两峰用0.20 mol/ L 甲酸或0.20 mol/ L 甲酸钠。也可以根据最高峰所在位置, 计算甲酸、甲酸钠的浓度选择参比液。
8. 测定各种核苷酸的含量和总回收率
分别合并(包括最高峰管在内) 各组分洗脱峰管内的洗脱液, 用量筒测出溶液总体积, 然后测定其A260 值, 参比对照液同上。根据层析柱上样液的A260 值以及层析后所得到的各组分A260值之和, 可以计算出离子交换柱层析的回收率( 注: RNA 的摩尔消光系数E260 为7.7x103 ～7.8x103 , 水解后增值40%) 。
9. 树脂的再生
使用过的离子交换树脂经过再生处理后, 可重复使用。可以在柱内处理, 也可以将树脂取出后处理。取出树脂的方法是用橡皮球由层析柱的下端向柱内吹气, 用烧杯收集流出的树脂。树脂再生的方法与未使用的新树脂预处理方法相同。也可以直接用1 mol/ L NaCl 溶液浸泡或洗涤, 最后用蒸馏水洗至流出液的pH值接近中性。
【结果处理】
1. 作出阴离子交换树脂柱层析分离核苷酸的洗脱曲线, 以层析流出液管数(或体积) 为横坐标, 以相应的A260 值为纵坐标, 作出洗脱曲线图。
2. 作出各单核苷酸的紫外吸收光谱图, 根据各组分溶液在230～300 nm 波长范围内的吸光值, 以波长( nm) 为横坐标, 吸光值为纵坐标, 作出它们的吸收光谱图。由图上求出每个单核苷酸组分的最大吸收峰的波长值, 同时, 计算出各个组分在不同波长的吸光值比值( 250/ 260 , 280/ 260 , 290/ 260) , 将它们与各核苷酸的标准值列表比较, 从而鉴定出各组分为何种核苷酸。
3. 根据层析上样液的A260 值, 以及层析后所得到的各组分A260 值之和, 计算出离子交换柱层析的回收率。
来源：丁香实验
