等电聚焦法
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原理
蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦( Isoelect rofocusing ,IEF) , 根据蛋白质的等电点不同进行分离; 第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE ) , 按亚基分子量大小进行分离。经过电荷和分子量两次分离后, 可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。蛋白质双向电泳是将蛋白质等电点和分子量两种特性结合起来进行蛋白质分离的技术, 因而具有较高的分辨率和灵敏度, 已成为蛋白质特别是复杂体系中的蛋白质检测和分析的一种强有力的生化手段。
材料与仪器
蛋白质
Acr Bis TEMED 原液 过硫酸铵 两性电解质载体 尿素 NP-40 NaOH H3PO4 SDS Tris-Cl 2-巯基乙醇 SDS-PAGE 甘氨酸 溴酚蓝 琼脂 MgCl2 抗坏血酸 PVP 甘油 2-巯基乙醇 丙酮
研钵 石英砂 烧杯 试管 玻璃棒 量筒 双向电泳槽
Acr Bis TEMED 原液 过硫酸铵 两性电解质载体 尿素 NP-40 NaOH H3PO4 SDS Tris-Cl 2-巯基乙醇 SDS-PAGE 甘氨酸 溴酚蓝 琼脂 MgCl2 抗坏血酸 PVP 甘油 2-巯基乙醇 丙酮
研钵 石英砂 烧杯 试管 玻璃棒 量筒 双向电泳槽
步骤
1. 叶片可溶性蛋白质的制备: 取叶片200 mg 加少许石英砂于液氮中研成粉末悬浮于3 ml 可溶性蛋白质抽提液中, 4 ℃放置1 h 以上, 于4 ℃ , 15000 r/ min 条件下离心15 min , 取上清液按1∶4与冷丙酮混合, - 20 ℃ 放置3 h 以上或过夜, 同样离心取沉淀, 用80% 丙酮洗两次, 同上离心, 真空干燥, 溶于400 μl(9 . 5 mol/ L 尿素, 5 mmol/ L K2CO3 , 1 . 25% SDS, 0 . 5% 2-巯基乙醇, 2 . 2% 两性电解质pH3 . 5～ 10 , 6% TritonX-100 ) 中, 经离心取上清液上样。
2. 第一向等电聚焦电泳( IEF)
(1 ) 玻璃管的准备: 取内径1 . 5～2 mm, 长16 cm 玻璃管用乙醇/ 盐酸为6/ 4 的溶液浸泡30 min , 再用蒸馏水冲洗, 烘干。灌胶前用封口膜封住管的一端, 并固定。
(2 ) 凝胶的配制与电聚焦: 取尿素2 . 06 g , 加入0 . 75 ml 蒸馏水, 0 . 75 ml 10%的NP-40 , 37 ℃水浴(不能超过37 ℃) , 待尿素充分溶解后加入0 . 5 ml 的凝胶原液和两性电解质0 . 05 ml ,pH3 . 5～10; 0 . 05 ml , pH4～ 6; 0 . 15 ml , pH6 ～8 , 再加入10 μl 10%l AP 和3 μl TEMED, 混匀后灌胶。在灌好的胶管的顶部覆盖1 cm 的双蒸水, 室温聚合1 h 以上, 待胶聚合好后吸去上层水溶液并加样30 μl , 再加入20 μl 样品覆盖液( 8 mol/ L 尿素,1 . 5%两性电解质( 0 . 3% pH3 . 5～ 10 , 0 . 3% pH4～ 6 , 0 . 9% pH6～8 ) , 5% NP-40 , 5%2-巯基乙醇) 和50 mmol/ L NaOH 至管口, 待电泳。电极液为: 上槽( 负极) 50 mmol/ L NaOH, 下槽(正极) 25 mmol/ LH3PO4 , 在室温下, 按200 V×15 min , 300 V×20 min , 400 V× 30 min ,500 V× 30 min , 600 V×16 h 的程序进行聚焦。
3. 取胶、pH 梯度的测定及胶条的平衡
聚焦结束后, 取出玻璃管, 吸去两端的溶液并以双蒸水清洗, 然后用10 ml 注射器套上200 μl 的tip 头吸取一些水从进样的一端轻轻将胶条打出。将要测定的胶条按每段1 cm 分成若干段后, 按顺序装入盛有脱气的双蒸水的小瓶中, 放4 ℃ 冰箱过夜,次日用pH 计分别测定各段的pH 值。对要进行第二向电泳SDSPAGE电泳的胶条则必须放入平衡液(60 mmol/ L Tris-Cl pH6 . 8 ,2%SDS, 5%2-巯基乙醇, 10% 甘油, 0 . 05%溴酚蓝) 中平衡10～30 min (平衡后的胶条酸端染成淡绿色而碱端染成深蓝色)。暂不进行第二向电泳的胶条可放入- 20 ℃保存数日。
4. 第二向SDS-PAGE 电泳
选用DDY-Ⅲ28D 型( 北京六一仪器厂生产) 电泳槽(规格为200 mm×130 mm×1 mm, 双板) , 分离胶浓度13% , 浓缩胶浓度5% , 分离胶长160 mm, 浓缩胶长40 mm ( 灌至玻璃板上沿) , 灌好浓缩胶后在一端插入单孔梳, 以便加入蛋白质分子量标准品。待胶聚合后, 将第一向平衡好的胶条平放于浓缩胶顶部(避免胶条拉伸) 并用1% 琼脂糖( 用电极缓冲液配制) 封胶。此时应注意避免胶条与浓缩胶上沿之间产生气泡( 可先用尖头滴管将加热到70 ℃ 的琼脂糖在浓缩胶上沿薄薄地涂上一层, 立即将平衡好的胶条平放于其上, 再用注射器针头挑动胶条使其结合完好)。待琼脂糖凝固后拔出单孔梳, 加入适量用变性胶处理过的marker , 加满电极缓冲液, 在冰箱中4 ℃ 电泳, 恒压200 V,至溴酚蓝达胶底部为止( 约5 h)。
5. 染色与脱色
电泳结束后, 剥下胶板, 放入染色液( 0 . 05% 考马斯亮蓝R-250 , 50%甲醇, 10% 甲酸40% 水) 中置室温2 h , 换脱色液(慢脱色液: 7% 乙酸; 快脱色液: 30% 乙醇, 10%乙酸) , 脱色至背景清晰。温度升高, 染色或脱色速度相对加快。脱色好后的胶最好立即照相, 也可放入7%乙酸于4 ℃冰箱保存以随时照相。
注意事项
样品预处理是双向电泳的关键。等电聚焦电泳的样品中必须去除盐离子、色素、酚类和核酸等物质, 还要加入防止蛋白质水解的抑制剂, 所以根据不同样品需要查阅有关资料进行样品预处理。聚焦的好坏与两性电解质的质量也有关系。
来源：丁香实验
