原理
血中磺胺类药物能与某些试剂发生反应，生成有色物质，通过比色对磺胺血浓度进行定量。根据用药后不同时间血中药物浓度的变化规律，计算血浆半衰期及其它药动学 参数。通过注射氯化汞复制急性肾衰的动物模型，比较正常及肾衰家兔内生肌酐清除率 的不同以及药动学参数的差别，以达到将生理、药理和病理生理的知识有机融合之目的。
碘胺类药物生成有色物质的反应如下： 一、重氮化：磺胺与亚硝酸反应，生成重氮盐，因亚硝酸易分解，无现成制剂，所以实验中用亚硝酸钠，使其与盐酸反应生成亚硝酸，磺胺也必须首先与盐酸反应，使其苯核上的氨基（-NH2）离子化生成铵类（-NH3+）化合物才能与亚硝酸发生重氮化反应。
具体反应如下：
1. NaNO2+HCl→HNO2+NaCl
偶联反应：盐酸重氮苯磺胺与麝香草酚在碱性溶液中发生偶联反应生成橙黄色 的偶氮化合物。
碘胺类药物生成有色物质的反应如下： 一、重氮化：磺胺与亚硝酸反应，生成重氮盐，因亚硝酸易分解，无现成制剂，所以实验中用亚硝酸钠，使其与盐酸反应生成亚硝酸，磺胺也必须首先与盐酸反应，使其苯核上的氨基（-NH2）离子化生成铵类（-NH3+）化合物才能与亚硝酸发生重氮化反应。
具体反应如下：
1. NaNO2+HCl→HNO2+NaCl
偶联反应：盐酸重氮苯磺胺与麝香草酚在碱性溶液中发生偶联反应生成橙黄色 的偶氮化合物。
材料与仪器
家兔
磺胺嘧啶钠 三氯醋酸 亚硝酸钠 麝香草酚 氢氧化钠 盐酸 磺胺嘧啶钠 肝素 氯化汞 乌拉坦 氯化钠 普鲁卡因 肝素钠溶液 肌酐标准应用液 苦味酸 氢氧化钠 碳酸 钠 碳酸氢钠
试管 吸管 加样器 注射器 采血杯 吸球 棉球 722 型分光光度计 离心机 恒温水浴 离心管 手术器械
磺胺嘧啶钠 三氯醋酸 亚硝酸钠 麝香草酚 氢氧化钠 盐酸 磺胺嘧啶钠 肝素 氯化汞 乌拉坦 氯化钠 普鲁卡因 肝素钠溶液 肌酐标准应用液 苦味酸 氢氧化钠 碳酸 钠 碳酸氢钠
试管 吸管 加样器 注射器 采血杯 吸球 棉球 722 型分光光度计 离心机 恒温水浴 离心管 手术器械
步骤
一、复制肾衰模型
实验前一天（18～20 h），取家兔（状态佳者）2 只，称重后一只皮下注射 1%HgCl2 溶液 1.2 ml/kg 体重，造成急性肾功能衰竭动物模型；另 1 只则在相同部位注射等量的生理 盐水作为正常对照。
二、收集尿液
1. 注射葡萄糖：分别取上述两兔称重，用乌拉坦 5 ml/kg 腹腔注射麻醉。固定于兔台上，耳缘静脉注射 5％葡萄糖溶液 15 ml/kg 体重(5 min 内注完)，以保证有足够的尿量。
2. 膀胱插管：腹部剪毛，在耻骨联合上 l.5 cm 处作腹正中切口，长约 4 cm。分离 皮下组织。沿腹白线切开腹膜，找到膀胱，作膀胱插管，先排空剩余尿液，然后收集 l h 尿液，并换算成每分钟排尿量。
三、采集血样
1. 颈动脉插管：将家兔背位固定于兔台上，剪去前颈部的毛，沿正中线由甲状软骨向下将颈部皮肤切开约 5 厘米。用血管钳钝性剥离皮下组织，分开肌肉，游离位于气管 侧方的一侧颈总动脉，将其同周围组织以及伴行的神经分离。为了防止动脉插管内凝血， 在手术进行到此时，从耳静脉注射 1% 肝素约 1 ml/kg。然后，将颈总动脉头侧端结扎， 心侧端用动脉夹夹住。在二者中间穿线打虚结，用眼科小剪刀在近头侧部结扎处向下剪 一小口，向颈动脉内插入充满肝素的三通管。结扎并加以固定。
2. 采集正常血液：从三通管放血约 0.5 ml，摇匀，备测药动学参数之用；另取 3 ml左右血液备测肌酐清除率之用。
3. 向家兔一侧耳缘静脉内快速注入 20％磺胺嘧啶钠１ ml/kg。
4. 在用药后第 1、3、5、15、30、60、90、120 分钟时，分别从连接颈动脉的三通 管采血约 0.5 ml、摇匀（应先放掉动脉插管内的残血）。
四、内生肌酐清除率测定
血、尿肌酐测定方法(见下表 5-2)和内生肌酐清除率的计算。 将尿样稀释：将尿液充分混合后，取出 1 ml 尿液，用蒸馏水将其稀释 100 倍，以备测定尿中肌酐含量。
将血样离心：将 3 ml 血液放入离心机中，3000 r/min，离心 20 分钟，取出血浆备用。 按下表加药：
4. 混匀，置 37 ℃水浴 20 min，再放到冷水盆中转动 1 min 使冷却。在 520 nm 波长处各以其相应的空白管调零，比色测定标准管和测定管的光密度。
5. 计算血中肌酐含量：
6. 注意事项
（1）血清、标准液等试剂量应准确。
（2）煮沸及冷却时间宜准确．否则颜色反应消退。
（3）所需试剂宜在使用前两周内配制，逾期则苦味酸颜色加深，光密度值随之增高。影响检测结果。此时需做试剂空白较正。方法如下(表 5-3)：
以 B0 为空白，测定 B 管的光密度。新配的试荆空白光密度在 0.01 左右。依下式计算：
（4）公式中的 0.23 为血浆中蛋白质含量在正常范围的蛋白干扰系数，若血浆蛋白质含量过高或过低，则宜采用传统的无蛋白滤液测定法。
（5）苦味酸具有爆炸性。配制时应先在容器内加少许蒸馏水，以防意外。
五、磺胺嘧啶钠药动学参数的测定
1. 脱蛋白：准确吸取各血样 0.2 ml，分别加入蒸馏水 1.8 ml（标准管 1.6 ml），５％ 三氯醋酸 4.0 ml，摇匀后将液体放入离心管中进行离心：1000 r/min，3 分钟。
2. 重氮化及偶联呈色：分别吸取不同时间的离心后的上清液 2.0 ml 加入对应的试管 中，并依次向各试管中加入下述试剂：
2N 盐酸 0.5 ml.
0.5％亚硝酸钠 0.5 ml.
0.5％麝香草酚 1.0 ml，摇匀。
3. 标准管的处理：同其他样品管所不同的是，需要准确加入 30mg％的磺胺嘧啶钠0.2 ml，以保证计算结果的准确性。
4. 比色：将各管内药液分别置于 722 型分光光度计的 0.5 cm 比色杯内，在波长为480 nm 处比色，以给药前的样品管调零点，测出各样品管的光密度值。 记录：
6. 计算：
（1）在其它条件（波长、比色杯、吸收系数、溶液稀释倍数等）一致的情况下，同一 种溶液浓度与光密度成正比，故可用下述公式求出样品管的磺胺血浓度（mg%）。
（2）作图：将上述计算好的各时间的血样浓度换算成对数浓度，在方格纸上对时间做图，找出消除相和分布相之间的拐点。
（3）用残数法计算磺嘧啶钠的药动学参数。
①用计算器对拐点后的消除相各时间及相应的血浓度进行直线回归，求出直线的截 距 a 和斜率 b；进而求出 B=10a，β=-2.303b（若为一房室，β为Ｋ）；根据 t1/2 =0.693/β,求出消除相半衰期 tl/2；最后写出消除相的经时方程 Ct=B·e-βt。
②根据 Ct=B·e-βt 计算各个时间的血药浓度。
③计算分布相的血药浓度：用拐点前实际测得的各血药浓度，减去其对应时间的消 除相的血药浓度，其差值即为分布相的血药浓度。用该浓度的对数对时间进行直线回归，
可求得 logA，α，进一步求出 A、tl/2、和分布相的经时方程 C t = Ae-αt。
④写出磺胺嘧啶钠在体内的总经时方程：C=Ae-αt ＋B·e-βt。 依该方程计算各时间 的理论血浓度值，可比较与实测值的差别。
⑤依药动学的公式计算磺胺嘧啶钠在家兔体内的各种动力学参数。
实验前一天（18～20 h），取家兔（状态佳者）2 只，称重后一只皮下注射 1%HgCl2 溶液 1.2 ml/kg 体重，造成急性肾功能衰竭动物模型；另 1 只则在相同部位注射等量的生理 盐水作为正常对照。
二、收集尿液
1. 注射葡萄糖：分别取上述两兔称重，用乌拉坦 5 ml/kg 腹腔注射麻醉。固定于兔台上，耳缘静脉注射 5％葡萄糖溶液 15 ml/kg 体重(5 min 内注完)，以保证有足够的尿量。
2. 膀胱插管：腹部剪毛，在耻骨联合上 l.5 cm 处作腹正中切口，长约 4 cm。分离 皮下组织。沿腹白线切开腹膜，找到膀胱，作膀胱插管，先排空剩余尿液，然后收集 l h 尿液，并换算成每分钟排尿量。
三、采集血样
1. 颈动脉插管：将家兔背位固定于兔台上，剪去前颈部的毛，沿正中线由甲状软骨向下将颈部皮肤切开约 5 厘米。用血管钳钝性剥离皮下组织，分开肌肉，游离位于气管 侧方的一侧颈总动脉，将其同周围组织以及伴行的神经分离。为了防止动脉插管内凝血， 在手术进行到此时，从耳静脉注射 1% 肝素约 1 ml/kg。然后，将颈总动脉头侧端结扎， 心侧端用动脉夹夹住。在二者中间穿线打虚结，用眼科小剪刀在近头侧部结扎处向下剪 一小口，向颈动脉内插入充满肝素的三通管。结扎并加以固定。
2. 采集正常血液：从三通管放血约 0.5 ml，摇匀，备测药动学参数之用；另取 3 ml左右血液备测肌酐清除率之用。
3. 向家兔一侧耳缘静脉内快速注入 20％磺胺嘧啶钠１ ml/kg。
4. 在用药后第 1、3、5、15、30、60、90、120 分钟时，分别从连接颈动脉的三通 管采血约 0.5 ml、摇匀（应先放掉动脉插管内的残血）。
四、内生肌酐清除率测定
血、尿肌酐测定方法(见下表 5-2)和内生肌酐清除率的计算。 将尿样稀释：将尿液充分混合后，取出 1 ml 尿液，用蒸馏水将其稀释 100 倍，以备测定尿中肌酐含量。
将血样离心：将 3 ml 血液放入离心机中，3000 r/min，离心 20 分钟，取出血浆备用。 按下表加药：
4. 混匀，置 37 ℃水浴 20 min，再放到冷水盆中转动 1 min 使冷却。在 520 nm 波长处各以其相应的空白管调零，比色测定标准管和测定管的光密度。
5. 计算血中肌酐含量：
6. 注意事项
（1）血清、标准液等试剂量应准确。
（2）煮沸及冷却时间宜准确．否则颜色反应消退。
（3）所需试剂宜在使用前两周内配制，逾期则苦味酸颜色加深，光密度值随之增高。影响检测结果。此时需做试剂空白较正。方法如下(表 5-3)：
以 B0 为空白，测定 B 管的光密度。新配的试荆空白光密度在 0.01 左右。依下式计算：
（4）公式中的 0.23 为血浆中蛋白质含量在正常范围的蛋白干扰系数，若血浆蛋白质含量过高或过低，则宜采用传统的无蛋白滤液测定法。
（5）苦味酸具有爆炸性。配制时应先在容器内加少许蒸馏水，以防意外。
五、磺胺嘧啶钠药动学参数的测定
1. 脱蛋白：准确吸取各血样 0.2 ml，分别加入蒸馏水 1.8 ml（标准管 1.6 ml），５％ 三氯醋酸 4.0 ml，摇匀后将液体放入离心管中进行离心：1000 r/min，3 分钟。
2. 重氮化及偶联呈色：分别吸取不同时间的离心后的上清液 2.0 ml 加入对应的试管 中，并依次向各试管中加入下述试剂：
2N 盐酸 0.5 ml.
0.5％亚硝酸钠 0.5 ml.
0.5％麝香草酚 1.0 ml，摇匀。
3. 标准管的处理：同其他样品管所不同的是，需要准确加入 30mg％的磺胺嘧啶钠0.2 ml，以保证计算结果的准确性。
4. 比色：将各管内药液分别置于 722 型分光光度计的 0.5 cm 比色杯内，在波长为480 nm 处比色，以给药前的样品管调零点，测出各样品管的光密度值。 记录：
6. 计算：
（1）在其它条件（波长、比色杯、吸收系数、溶液稀释倍数等）一致的情况下，同一 种溶液浓度与光密度成正比，故可用下述公式求出样品管的磺胺血浓度（mg%）。
（2）作图：将上述计算好的各时间的血样浓度换算成对数浓度，在方格纸上对时间做图，找出消除相和分布相之间的拐点。
（3）用残数法计算磺嘧啶钠的药动学参数。
①用计算器对拐点后的消除相各时间及相应的血浓度进行直线回归，求出直线的截 距 a 和斜率 b；进而求出 B=10a，β=-2.303b（若为一房室，β为Ｋ）；根据 t1/2 =0.693/β,求出消除相半衰期 tl/2；最后写出消除相的经时方程 Ct=B·e-βt。
②根据 Ct=B·e-βt 计算各个时间的血药浓度。
③计算分布相的血药浓度：用拐点前实际测得的各血药浓度，减去其对应时间的消 除相的血药浓度，其差值即为分布相的血药浓度。用该浓度的对数对时间进行直线回归，
可求得 logA，α，进一步求出 A、tl/2、和分布相的经时方程 C t = Ae-αt。
④写出磺胺嘧啶钠在体内的总经时方程：C=Ae-αt ＋B·e-βt。 依该方程计算各时间 的理论血浓度值，可比较与实测值的差别。
⑤依药动学的公式计算磺胺嘧啶钠在家兔体内的各种动力学参数。
注意事项
1. 血清、标准液等试剂量应准确。
2. 煮沸及冷却时间宜准确．否则颜色反应消退。
3. 所需试剂宜在使用前两周内配制，逾期则苦味酸颜色加深，光密度值随之增高。
2. 煮沸及冷却时间宜准确．否则颜色反应消退。
3. 所需试剂宜在使用前两周内配制，逾期则苦味酸颜色加深，光密度值随之增高。
来源：丁香实验
