革兰氏染色法（病原生物的基本形态结构观察实验）

微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。 (注：任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。)

细菌的等电点较低，pH值大约在2—5 之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。影响染色的其它因素，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用。此外，培养基的组成、菌龄、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等，也都能影响细菌的染色。

微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染料使微生物染色，但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别微生物的作用。故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。微生物检验中常用的是单染色法和革兰氏染色法。

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884 年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（复红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。用于革兰氏染色的初染液一般是碱性染料初染液结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，而且将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液为稀释的石炭酸复红液。

一、试剂与器材

1. 器材：牙签、显微镜、载玻片、酒精灯、染色缸等。

2. 染色液：革兰氏染色液一套（结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、稀释石炭酸复红液）。

二、细菌标本片的制作

1. 涂片

在干净的载玻片上滴1 滴蒸馏水，用牙签挑取牙垢少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1 厘米的薄层。

2. 干燥

涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

3. 固定

标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个：

（1）杀死微生物，固定细胞结构。

（2）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。

（3）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。

固定常常利用高温，手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次，共约2-3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。

三、染色

1. 初染

加结晶紫1 滴，约1 分钟，水洗。

2. 媒染

滴加碘液冲去残水，并覆盖约1 分钟，水洗。

3. 脱色

将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精无色或稍呈淡紫色时为止，约20-30 秒钟，立即用水冲净酒精。

4. 复染

用稀释石炭酸复红液染30 秒后，水洗。

5. 镜检

用吸水纸干燥后，置油镜观察。

四、结果判断

革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

1. 革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。

2. 若选用培养细菌染色，选用18—24 小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

一、革兰氏染色液的配制

1. 结晶紫(crystal violet)液

结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2 g溶于20 mL95%乙醇中)20 mL，1%草酸铵水溶液80 mL 将两液混匀置24 h 后过滤即成。此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。

2. 卢戈(Lugol)氏碘液

碘1 g，碘化钾2 g，蒸馏水300 mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至300 mL 即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。

3. 95%乙醇

用于脱色，脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。

4. 稀释石炭酸复红溶液

碱性复红乙醇饱和液(碱性复红1 g，95%乙醇l0 mL，5%石炭酸90 mL混合溶解即成碱性复红乙醇饱和液)，取石炭酸复红饱和液l0 mL 加蒸馏水90 mL 即成。