机械搅拌发酵罐发酵法

从试管菌种开始，通过逐级扩大增加培养物，最终使用机械搅拌罐发酵枯草芽孢杆菌。摇瓶培养是实验室常用的通风培养方法，通过装有液体培养物的三角瓶放在摇床上振荡培养，以满足微生物的生长、繁殖及产生许多代谢产物对氧的需求，它是实验室摸索工艺条件的常用方法。

一、实验材料

枯草芽孢杆菌， 种子培养基，发酵培养基，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶，发酵罐。

二、实验方法

1. 工艺流程

试管斜面菌种（12 h，37℃）→接种(1环菌苔)→摇瓶种子培养液中，250 mL三角瓶振荡培养（12 h，37℃）→种子培养液，接种（1%－5%）→机械搅拌发酵罐发酵。

2. 发酵罐种子液的制备

摇瓶种子培养基：葡萄糖 20 g，牛肉膏1 g，蛋白胨5 g， NaCl 5 g，H₂ O 1 000 ml，pH自然 ，高压灭菌锅121℃灭菌20 min。

摇瓶种子培养基分装于250ml三角瓶，每瓶50ml。从斜面上挑取一环菌种，接入摇瓶种子培养基，37℃，150rpm振荡培养12小时即为种子液。

3. 发酵培养基制备

发酵培养基：蔗糖20 g，淀粉20 g，酵母膏1 g，蛋白胨5 g， NaNO₃ 3 g，KH₂PO₄ 5 g， CaCO₃ 10 g，H2O 1 000 ml；pH7.0。

淀粉糊化：淀粉：水＝1：4加入预热至60℃水中，边加边搅拌，煮沸10分钟成糊状（煮沸过程中不断搅拌）。

4. 发酵（演示）

①空消：空罐灭菌。

②实消：将发酵培养基5L从进样口倒入15 L发酵罐中，盖上盖子。检查发酵罐安装完好后， 105℃灭菌15分钟。

③接种：可以采用火焰接种法，在接种口放置酒精圈，点燃后，将菌种通过火焰圈迅速倒入发酵罐内，进行计时培养。

④发酵：种子培养好后，将种子接到发酵罐中，接种量1-5%，36°C—37°C 控温通风培养，搅拌转速200转/分，0～1 h，通风比l：0.5～0.8；35 hr以后调速380转/分；24～28小时，通风1：1.0。每6小时测定活力一次，外观糖一次；每2小时测pH一次，记录通风量，转速、温度等。发酵过程监测时，注意观察发酵罐的结构，测定结果记录于表，测定时同时镜检。定期测定菌浓，当菌浓达到最高时结束发酵。

⑤取样：自培养操作开始起，每6h取1次样。取样前后，要用蒸汽冲取样口。

一、试管接摇瓶前，摇瓶培养基要设肉汤平板划线空白对照，检查摇瓶种子培养基是否灭菌彻底。

二、种子培养液接发酵罐之前，要对种子培养液镜检，检查是否有杂菌污染。