材料与仪器
Sf细胞
胎牛血清 PBS SDS 蛋白酶抑制剂 裂解缓冲液
培养瓶 培养箱 离心机 转子 水浴锅
步骤
1. 接种2.5x108 Sf9细胞于含5 ml 完全培养液/10%胎牛血清的25 cm2 培养瓶中，27℃温育≥2 h。从含无血清完全培养液和重组蚀斑的1 ml 病毒贮液中取0.5 ml 分别加入各个培养瓶。4℃保存剩余的0.5 ml 重组病毒，待以后用于蚀斑试验。
2. 培养瓶置27℃温育4~5天，毎天检查感染迹象。4~5天后，将培养液转移至15 ml 离心管中，收获病毒。
2. 培养瓶置27℃温育4~5天，毎天检查感染迹象。4~5天后，将培养液转移至15 ml 离心管中，收获病毒。
3. 于4℃1 000 g 离心10 min，将含有扩增病毒的上清转移至一支无菌15 ml 聚丙烯离心管中。
4. 接种2.5x106 Sf9细胞于含5 ml 完全培养液/10%胎牛血清的25 cm2 培养瓶中。为每 ―待测病毒贮液准备一个培养瓶，另准备一个作为非感染对照。27℃温育≥2 h，使细胞贴壁。弃去细胞培养液并向培养瓶中加入1.5 ml 扩增的病毒贮液，27℃温育2天。
5. 从塔养瓶中轻轻移去细胞以收获之，并将细胞和培养液转移至15 ml 聚丙烯离心管中。
5. 从塔养瓶中轻轻移去细胞以收获之，并将细胞和培养液转移至15 ml 聚丙烯离心管中。
6. 于4℃，1 000 g 离心10 min，如果目的蛋白是分泌型蛋白质，将培养上清移至一新管， 进行步骤8。如果待研究蛋白是胞内蛋白，则弃上清，用PBS轻轻将细胞团块重悬洗涤，重复离心并弃上清。
7. 直接加入500 ul 1xSDS样品缓冲液，煮沸细胞团块，如因DNA的存在造成样品太粘稠，可超声裂解样品，持续超声处理直到粘性消除，然后转至步骤9。另一变通方法是用0.5 ml 补充了蛋白酶抑制剂的适当裂解缓冲液裂解细胞团块，4℃微量离心10 min，澄清裂解物，将上清转移至一个新管。取0.1 ml 的各种裂解物加至100 ul 2xSDS样品缓冲液中，在沸水浴中煮沸3 min，剩余裂解物冻存于-80℃，可保存数月。
8. 用Bradford的方法，确定培养物上清中分泌蛋白（步骤6）的浓度或细胞裂解物中细胞内蛋白（步骤7）的浓度。
9. 用下列方法中的一种分析每一样品中的蛋白质：
7. 直接加入500 ul 1xSDS样品缓冲液，煮沸细胞团块，如因DNA的存在造成样品太粘稠，可超声裂解样品，持续超声处理直到粘性消除，然后转至步骤9。另一变通方法是用0.5 ml 补充了蛋白酶抑制剂的适当裂解缓冲液裂解细胞团块，4℃微量离心10 min，澄清裂解物，将上清转移至一个新管。取0.1 ml 的各种裂解物加至100 ul 2xSDS样品缓冲液中，在沸水浴中煮沸3 min，剩余裂解物冻存于-80℃，可保存数月。
8. 用Bradford的方法，确定培养物上清中分泌蛋白（步骤6）的浓度或细胞裂解物中细胞内蛋白（步骤7）的浓度。
9. 用下列方法中的一种分析每一样品中的蛋白质：
（1）免疫印迹：在单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，每一泳道加入20~40 ug 细胞总蛋白。记住要包括非感染对照。
（2）考马斯亮蓝染色：在单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，每一泳道加入 20~40 ug 细胞总蛋白。如果重组病毒不纯，则只有在感染细胞中重组蛋白产量很高时才用此方法检测。
（3）功能分析：如迁移率变动的DNA结合分析，体外激酶分析（用于蛋白激酶），核苷结合分析（用于结合核苷的蛋白），胸苷掺入分析（用于生长因子蛋白质），或者任何用于检测目的蛋白的典型分析方法。
（4）重组蛋白的代谢标记。
10. 解释结果，以鉴定出哪一个假定的重组蚀斑是产生所需蛋白的重组子，将其进行蚀斑纯化，以使其免受任何野生型病毒污染。制备大量病毒毒种贮 液，并测定重组病毒的滴度。
来源：丁香实验
