二维聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品制备
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简介
多种用于蛋内质组学研究的蛋白质分离方法得到了发展，如基因芯片技术的应用. 蛋白复合物的质谱直接分析、亲和标签的使用以及大规模酵母双杂交筛选系统。但是，二维聚丙烯酰胺凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2-DE) 依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白混合物所选择的核心技术，这是由于它在同时分离成千蛋白质时所具有的无可比拟的分离能力，以及随后的可用于计算机定量分析差异表达蛋白质的高灵敏度的显色技术，还有对 2-DE 胶上蛋白质用高灵敏度微量化学方法进行鉴定和表征相对比较容易。来源：《蛋白质组学：从序列到功能》
来源：丁香实验
操作方法
可溶性液体样品如血清、血浆、尿样，脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物，经很少的前处理便可进行 2-DE 分析。含蛋白质浓度较高的样品，如血浆和血清，可用适量样品溶解缓冲液稀释后肯接分析。但是，诸如白蛋白和免疫球蛋白一类的高丰宽蛋白质在2-DE图谱上常干扰其他表达量少的成分，将这些高丰度蛋白质去除可以克服这个问题, 但同时叶能非特异性去除其他蛋白质。其他类型的液态样品可能含有较低的蛋白质浓度或较高盐
组织样品准备固体组织样品常在溶解缓冲液中破碎，最好的方法是在组织冷冻及液氮温度的条件下破碎。包裹在铝箔并贮存于液氮中的较小组织样品，可以夹在两个冷研块或基体中间用杵和研钵在液氮环境下压碎，大的组织块可在溶解缓冲液中用旋转叶片型匀浆器进行匀浆处理，但尽量避免加热和起泡沫。组织样品的开个特殊问题是样品的异质性，组织样品和来源于疾病的样品包含许多种不同类型的细胞，不太可能分别收集组织的疾病区域和非疾病区域。几种用于
细胞对体外悬浮培养生长的细胞或周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细胞），理想的方法是通过离心收集，用磷酸盐缓冲液清洗并溶于样品缓冲液。对于在固体基质中培养的细胞，应首先去除培养基质，用 PBS 或等渗蔗糖溶液清洗细胞层，后者是减少可能干扰一向 IEF 的盐的特别有效的方法。然后通过刮擦方法收获细胞，但应避免使用蛋白裂解酶，或者，加入少量体积溶解缓冲液．将附着在基质上的细胞直接裂解。如果细胞核酸含植过高而导
样品分级由于真核组织蛋白质表达的高动态范围和多样性，有时必须对蛋白质进行分级处理，以降低样品的复杂性并富集低拷贝蛋白质。蛋白质预分级可以用亚细胞分级、液相电泳、吸附色谱和选择性沉淀等方法来实现。此外，还有一种方法是根据蛋白质在一系列溶解能力还和增强的缓冲液中溶解性能不同，而实现对细胞或组织蛋白质的分级提取
