氨基酸代谢标记实验
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简介
代谢标记技术用于研究蛋白质的生物合成、加工、细胞内运输、分泌、降解和物理化学特性。
来源：精编分子生物学实验指南（第五版）
操作方法
1. 室温融化 [35S] 标记甲硫氨酸，并用预热的（37℃）脉冲标记培养基制备 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室温下 300 g 离心 5 min，获得悬液中 0.5 × 107~2 × 107 细胞。用 10 ml 预热的脉冲标记培养基洗细胞。室温下 300 g 离心 5 min, 吸弃上清。轻柔敲打试管底部使细胞重悬并再洗一次。3. 用预热脉冲标记的培养基重悬细胞，使其浓度
备择方案 1 对贴壁细胞1. 在 100 mm 组织培养皿中培养细胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 细胞，取决于细胞类型）。2. 如上所述制备 [35S] 甲硫氨酸的工作液体（见基本方案步骤 1）。3. 吸弃上清并用 10 ml 预热（37℃）脉冲标记培养基轻柔洗细胞 2 次，弃掉洗液。4. 加 5 ml 预热脉冲标记培养基，在潮湿、37℃、5% CO2 培养箱内孵育 15 min，以除去细
备择方案 2 示踪标记细胞1. 每个时间点和每个样品准备 0.5 × 107 ~2 × 107 细胞， 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 细胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脉冲标记 10~30 min （见基本方案步骤 1~4，或见备择方案 1 步骤 1~5）。2. 去除 [35S] 甲硫氨酸的工作溶液，用 10 ml 37℃ 的示踪培养基洗一次，并加入 10 ml 37℃ 的示
备择方案 3 长期细胞标记1. 在预热的 37℃ 长期标记培养基中制备 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液（见基本方案步骤 1）。2.1 对于悬浮细胞：用预热的长期标记培养基准备并洗细胞一次（见基本方案步骤 2）。在 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液中重悬 0.5 ×107～2 ×107 细胞，并转移到 75 cm2 组织培养瓶中。2.2 对贴壁细胞： 75
辅助方案 TCA沉淀测定标记掺入量1. 加 10～20 μl 被标记的细胞悬液到 0.1 ml 0.1％（m/V）BSA/0.02％（m/V）NaN3 中，置于冰上。2. 加 1 ml 冷冻的 10％（m/V）TCA 溶液。剧烈振荡混匀，在冰上孵育 30 min。3. 在真空滤过装置内，滤过细胞悬液到 2.5 cm 玻璃微纤维滤膜上。4. 用 5ml 冷冻 10％TCA 溶液洗膜 2 次，再用乙醇洗 2 次。空气干燥 30 min
