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氨基酸代谢标记实验

实验分类:

蛋白质实验

最新修订时间:

简介

代谢标记技术用于研究蛋白质的生物合成、加工、细胞内运输、分泌、降解和物理化学特性。

 

来源:精编分子生物学实验指南(第五版)

操作方法

基本方案 对悬浮培养细胞

1. 室温融化 [35S] 标记甲硫氨酸,并用预热的(37℃)脉冲标记培养基制备 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室温下 300 g 离心 5 min,获得悬液中 0.5 × 107~2 × 107 细胞。用 10 ml 预热的脉冲标记培养基洗细胞。室温下 300 g 离心 5 min, 吸弃上清。轻柔敲打试管底部使细胞重悬并再洗一次。3. 用预热脉冲标记的培养基重悬细胞,使其浓度

备择方案 1 对贴壁细胞

1. 在 100 mm 组织培养皿中培养细胞到 80%~90% 融合(0.5 × 107~2 × 107 细胞,取决于细胞类型)。2. 如上所述制备 [35S] 甲硫氨酸的工作液体(见基本方案步骤 1)。3. 吸弃上清并用 10 ml 预热(37℃)脉冲标记培养基轻柔洗细胞 2 次,弃掉洗液。4. 加 5 ml 预热脉冲标记培养基,在潮湿、37℃、5% CO2 培养箱内孵育 15 min,以除去细

备择方案 2 示踪标记细胞

1. 每个时间点和每个样品准备 0.5 × 107 ~2 × 107 细胞, 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 细胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脉冲标记 10~30 min (见基本方案步骤 1~4,或见备择方案 1 步骤 1~5)。2. 去除 [35S] 甲硫氨酸的工作溶液,用 10 ml 37℃ 的示踪培养基洗一次,并加入 10 ml 37℃ 的示

备择方案 3 长期细胞标记

1. 在预热的 37℃ 长期标记培养基中制备 0.02~0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液(见基本方案步骤 1)。2.1 对于悬浮细胞:用预热的长期标记培养基准备并洗细胞一次(见基本方案步骤 2)。在 25 ml 0.02~0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液中重悬 0.5 ×107~2 ×107 细胞,并转移到 75 cm2 组织培养瓶中。2.2 对贴壁细胞: 75

辅助方案 TCA沉淀测定标记掺入量

1. 加 10~20 μl 被标记的细胞悬液到 0.1 ml 0.1%(m/V)BSA/0.02%(m/V)NaN3 中,置于冰上。2. 加 1 ml 冷冻的 10%(m/V)TCA 溶液。剧烈振荡混匀,在冰上孵育 30 min。3. 在真空滤过装置内,滤过细胞悬液到 2.5 cm 玻璃微纤维滤膜上。4. 用 5ml 冷冻 10%TCA 溶液洗膜 2 次,再用乙醇洗 2 次。空气干燥 30 min

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