PEG 介导的脾细胞与骨髓瘤细胞的融合

细胞融合的方法有生物法、化学法和物理法。化学法常用的是化学诱导剂聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）结合高 pH、高钙离子法。该法操作方便，目前已成为人工诱导细胞融合的主要手段。

PEG 介导的细胞融合的基本原理是利用 PEG 使细胞相互接触部位的膜结构发生重排，加之膜脂双层的相互亲和以及彼此间表面张力的作用，引起相邻质膜在修复时相互合并在一起，导致细胞之间发生融合。PEG 介导的细胞融合率受下述因素影响。

① PEG 的分子量与浓度：分子量及其浓度与融合率成正比；但分子量越大、浓度越高，对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，常用的 PEG 相对分子质量为 1000～4000，浓度为 40％～60％。

② PEG 的 pH 值：pH 值在 8.0～8.2 之间融合效率最高。

③ 融合时的温度：由于生物膜的流动性与温度成正比，在细胞可承受的温度范围内适当提高温度，可提高融合率。

④ 处理时间：处理时间越长，融合率越高，但对细胞的毒害也越大。故一般将处理时间限制在 1.0～1.5 min 之内。若融合后不继续培养，可将处理时间延长至 20 min。

细胞融合不仅可用于核质关系、基因定位、体细胞的遗传和发育等生物学的基础理论研究，而且在生产实践上还有重要的应用价值，目前已成功应用于单克隆抗体的制备、新品种的培养、性状的改良、疾病的治疗和潜伏病毒的研究等领域。

① 普通低速离心机

② 恒温水浴锅

③ 普通光学显微镜

④ 血细胞计数板

⑤ 天平、剪刀、镊子、50 ml 无菌离心管、96 孔培养板、培养皿、烧杯、吸管、盖玻片、载玻片

试剂：

① 材料：鼠、培养的骨髓瘤细胞

② PBS

③ HAT 选择培养液

④ HT 培养液

⑤ PEG（M，＝4000）（50％）

（一）试剂配制

（1）HAT 选择培养液 常用两种储存液（100xHT 和 100xA）来稀释配制 HAT 培养液。

① 100xHT 称取次黄嘌呤 136.1 mg 和胸腺嘧啶核苷 38.8 mg，加细胞培养用水至 100 ml。若溶解不佳，加热（70 ℃）助溶。100 倍储存液中，次黄嘌呤浓度为 10 mmol/L，胸苷为 1.6 mmol/L。0.22 μm 滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃ 保存，可保存 1 年。

② 100xA 称取氨基蝶呤 1.76 mg，溶解于细胞培养用水中。加 1.0 mol/L NaOH 0.5 ml 助溶，再用 1 mol/L HC1 将 pH 调回至中性，定容至 100 ml。注意勿调成酸性，因为氨基蝶呤对酸敏感。100 倍储存液中氨基蝶呤的浓度为 0.04 mmol/L。0.22 μm 滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃ 保存，可保存 1 年。

③ 将 100xHT 和 100xA 各按 1:100 比例加到含小牛血清的完全培养基中，即成 HAT 选择培养液。其中各成分的最终浓度分别为：H,1x10-4 mol/L;A,4x10-7 mol/L;T,1.6x10-5 mol/L。

（2）100xHT 培养液 10 mmol/L 次黄嘌呤钠盐；1.6 mmol/L 胸腺嘧啶脱氧核苷。

（二）准备脾细胞

（1）处死动物并用乙醇擦拭腹部，剖开腹部暴露脾脏。

（2）用灭菌的镊子和剪刀取出脾脏，置于一盛有 50 ml 灭菌 PBS 的烧杯中，洗去血污。

（3）把脾脏移入一盛有 20 ml 灭菌 PBS 的培养皿中。除去所有的多余组织和脂肪，并用 PBS 冲洗脾脏。

（4）把脾脏移入盛有 20 ml 灭菌 PBS 的培养皿，用灭菌的剪刀、镊子剪碎组织，制成单细胞悬液。

（5）收集细胞于 50 ml 离心管，用 10 ml 灭菌的 PBS 清洗培养皿并转移入离心管。静置 1 min。

（6）小心把细胞悬液移入一新的离心管，不要让管底的组织块一并转入。

（7）用 10 ml 灭菌的 PBS 清洗有组织块的离心管，静置 1 min 后小心移出细胞悬液，并和上一次的细胞悬液混合。

（8）室温下以 800 g 离心 5 min。

（9）小心弃上清液。用 50 ml 灭菌的 PBS 重悬细胞，重复离心。

（10）小心弃上清液。在 10 ml 灭菌的 PBS 中重悬细胞。

（11）取 1 滴进行细胞计数。

（三）准备骨髓瘤细胞

（1）从 2～4 个培养瓶中收集处于对数生长期的骨髓瘤细胞。

（2）用灭菌的 PBS 清洗细胞，800 g 离心 5 min。

（3）重复洗涤、离心一次。

（4）用 10 ml 灭菌的 PBS 重悬细胞。

（5）取 1 滴进行细胞计数。

（四）融合步骤

（1）以 3:1～5:1（脾细胞：骨髓瘤细胞）的比例在 50 ml 离心管中混合脾细胞和骨髓瘤细胞（细胞总数约为 106）。室温下 800 g 离心 5 min。

（2）尽可能地弃去上清液。轻叩管底使沉淀松动，置 37 ℃（39 ℃ 更佳）水浴中预温。

（3）缓慢逐滴加入 1 ml 37 ℃ 预温的 50％ PEG 溶液，边加边轻摇混匀，加完后用吸管轻轻吹打混匀。37 ℃ 静置 1 min。

（4）用 20 ml 灭菌的 PBS 稀释 PEG。注意动作一定要缓慢，尤其是开始稀释时（最初 1 ml 在 1 min 内加完，之后可加快速度）。800 g 离心 5 min，弃上清液。

（5）重复洗涤、离心一次。

（6）弃上清。在 HAT 培养液中重悬沉淀，使细胞密度为 5x105 个/ml

（7）转入 96 孔培养板，每孔 0.2 ml。在 CO₂ 培养箱中 37 ℃ 培养

5～7 d，其间根据需要换 HAT 培养液。

（8）观察细胞融合结果。